基因编辑技术CRISPR/Cas9有望攻克鲤科疱疹病毒3型疾病

鲤科疱疹病毒病（KHVD）是由（CyHV-3），又称锦鲤疱疹病毒（KHV）感染鲤鱼和锦鲤引起的一种急性传染病。目前，对于该病的治疗尚缺乏有效方法，给我国鲤鱼养殖带来了巨大的经济损失。　　近期，东北林业大学、吉林大学联合利用基因编辑技术CRISPR/Cas9（图1），在体外鲤鱼鳍条KF-1细胞系中成功抑制了KHV病毒的复制。CRISPR系统是细菌的一种获得性免疫系统，细菌被病毒侵染后，可截取病毒DNA片段整合进入基因组。当细菌再次被病毒侵染时，便可造成病毒基因组DNA中特定位置的双链断裂，从而抑制病毒在胞内的复制，对其形成免疫。图1 CRISPR原理图利用CRISPR原理，东北林业大学赵翊丞、于泽等依据KHV基因组TK和DP基因设计了crRNAs，并在crRNA-TK和crRNA-DP引物的作用下，扩增得到两个带有BbsI酶切粘性末端的DNA双链退火产物。将扩增产物分别连接到含有puromycin抗性基因的pX330-puro载体上，转入感受态细胞后进行PCR验证，最终得到阳性重组质粒pX330-puroTK和pX330-puroDP。　　完成质粒构建后，通过细胞试验对两个重组质粒抑制KHV病毒复制的效果进行了评估。首先，利用KHV病毒敏感细胞系KF-1感染KHV病毒后，加入pX330-puro TK和pX330-puro DP混合质粒转染细胞系，并采用荧光定量PCR和病毒的半数细胞感染量测定KHV在转染细胞中的增殖。同时，将pX330-puro TK和pX330-puro DP转染正常KF-1细胞系，通过筛选成功转染的阳性细胞并培养后，接入KHV毒液培养7天，利用荧光定量PCR以及病毒滴度测定法对病毒增殖进行检测。以上两项试验结果均显示（图2），pX330-puro TK和pX330-puro DP能有效抑制KHV病毒在细胞内的复制。图2 细胞实验结果图通过试验证明，该技术对于定向敲除KHV关键基因的靶向精确性高，使得细胞内病毒复制得到有效抑制。这为早日攻克鲤科疱疹病毒3型病毒病提供了一种新思路、新方法。 来源：Inhibiting cyprinid herpesvirus-3 replication with CRISPR/Cas9，Biotechnology Letters，2015，38(4)：1-6作者：刘衍鹏 海产动物疾病防控国家工程实验室　　本稿为海产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室原创编译整理，转载须经过同意并注明来源、作者