摘要：今朝，同意在人类和动物物种上应用的口服疫苗数目有限，开辟有用平安的口服疫苗对鱼类免疫学家一向是一个挑衅。口服疫苗后果欠安的主要原因是因为恶劣的胃情况抗衡原的损坏，以及肠道情况的高耐受性和疫苗设计方式的不足。在本文中，我们会商了今朝年夜范围养殖鱼类口服疫苗的开辟方式;鉴戒人类和兽医疫苗的开辟经验，从鱼类粘膜免疫学和新分子生物学的最新进展的角度，提出了鱼类口服疫苗的设计方式;并会商了用斑马鱼作为预筛选动物模子的长处和毛病，旨在加速养殖鱼类疫苗的设计和验证。
1、引言
今朝，用于养殖鱼类的疫苗尽年夜大都是针对细菌病原体，只有少数是针对病毒的。今朝市售疫苗的给药道路是口服(经由过程混饲)、浸泡、腹腔打针(ip)或肌肉打针(im)。固然打针接种疫苗对鱼的维护最有用，但操纵难度较年夜。腹腔打针凡是用于赐与水包油型打针疫苗，而肌肉打针最常用于赐与DNA质粒。水包油型打针疫苗会发生局部副感化，包含组织炎症、组织粘连或组织坏逝世。鱼太小或不克不及打针接种疫苗的，可经由过程口服或浸泡接种疫苗，但这些方式凡是后果欠安、维护周期短。今朝，也有开辟出浸泡、口服和打针组合应用的疫苗接种方式来确保全部周期都能受到疫苗的维护。
口服疫苗免疫还存在引诱耐受后的潜伏风险，特殊是免疫功效不成熟的幼鱼，是以，鱼类免疫学家斟酌正在成长的粘膜疫苗。从动物的福利和处置本钱来看，鱼用口服粘膜疫苗，将是疫苗接种的幻想方式，但还没有经由过程此道路实现年夜范围疫苗接种。
本文在总结人用和兽用口服疫苗的基本上，将粘膜免疫利用于鱼用口服疫苗研制，特殊在抗原的类型、剂量、灭活等方式上的研讨。起首，经由过程摸索病原体的性质、鱼体性质和疫苗接种方面的共性，分析鱼口服传递抗原耐受的可能前提。其次，从免疫维护机制进手，针抗衡原耐受性题目和实现疫苗口服题目进行解决。再次，针对局部抗原呈递细胞(APC)和M细胞进行探讨，选择出增进抗原粘附于M细胞或强烈激活局部非特异性免疫和特异性免疫应答的粘膜免疫佐剂。
2、人类和兽用疫苗的研讨近况
在哺乳动物中，胃肠外抗原给药会触发弱的粘膜反映，而在粘膜概况的抗原给药会有用地触发局部以及全身性的体液和细胞介导的反映。在粘膜概况触发对粘膜病原体的特异性免疫反映维护的主要性是公认的。
经100多年研讨，被同意的人用粘膜疫苗仅有5个，包含四个口服疫苗，预防小儿麻木病毒，轮状病毒，沙门氏菌，伤冷和霍乱及一个鼻用抗流感病毒疫苗。
贸易化的鱼类病原体的口服疫苗今朝仅有年夜西洋鲑和银鲑贸易口服疫苗、年夜扇贝口服疫苗，前者用于抵抗鲑鱼立克次氏体、胰腺沾染性病毒和沾染性鲑鱼贫血病毒、虹鳟抗胰腺沾染性病毒、彩虹鳟鱼和鲈鱼抗鳗弧菌;后者用于抵抗加氏乳球菌。但与人类口服疫苗相似，鱼用口服疫苗只能供给弱效或短期的维护。
3、当前胜利的和受存眷的人类及兽医粘膜疫苗
所有允许应用在人类和兽医物种的口服疫苗都是针对粘膜病原体，这些粘膜病原体要么沾染粘膜概况自己，要么以粘膜为进口，再进行全身性沾染。
只有少数胜利的口服疫苗是在减毒活的病毒或细菌的基本上，模拟病原体沾染的道路，并触发强盛的局部免疫反映，且不须要任何额外的佐剂。减毒活疫苗的特色是平安性差，原因是不克不及包管病原体不会恢复到致病状况乃至易动人的发病。
出于便利和平安性的斟酌，鱼类口服疫苗的抗原研讨集中于应用灭活病原体(加热或甲醛灭活)，虽没有具体提到是否赐与佐剂，但年夜大都疫苗都参加了抗原传递体系维护载体，旨在避免抗原在胃降解，也可能增进抗原粘附粘膜概况，或可能作为局部的炎症旌旗灯号。灭活病原体的上风是相对平安，但其维护是弱效和短期的且与血清IgM程度有关，而疾病易感与血清IgM程度降落有关。还有报道，反复口服给药(灭活病原体)可包管鱼体在全部出产周期中的高血清IgM，阐明口服抗原可以引起全身反映，但也阐明鱼没有树立强盛的记忆效应和形成耐受性。
4、非胶囊化鱼类口服疫苗研讨策略与后果
现有的对疫苗后果研讨报道重要包含，第一，鉴于今朝胜利允许的鱼用疫苗，以及灭活病原体的便利性和平安性，大批的研讨集中在应用非封装(灭活的)细菌、酵母或植物表达细菌或病毒抗原。这种策略是基于细胞壁自己可能作为对肠道情况的天然维护樊篱的假设成立下，在全部细胞中表达的抗原可能不须要进一步的封装。第二，在测试的时光(多为2-3个月)内，按剂量持续给药可实现足够的引诱响应并付与维护，但大都只研讨到最后一次免疫后的10～30天。第三，在剂量雷同的情形下，添加佐剂的疫苗，可以加强疫苗后果。应用分歧类型的细胞疫苗，与无佐剂的雷同疫苗比拟，添加25% V / V 10%钾硫酸铝可增添虹鳟对鳗弧菌的抵御力。第四，肠道微生物可能是适合的疫苗载体，共生可以保持他们假寓肠道并在粘膜概况连续传递抗原的才能。
尽管存在良多有前程的方式，但仍然很难体系的解决应用剂量、疫苗类型、疫苗效能的持久维护(>3个月)等题目，且年夜大都研讨中的病原体沾染没有采取天然的沾染道路。
5、胶囊化口服疫苗的研讨对策与后果
对照前面提到的细菌或酵母和植物疫苗，良多更懦弱的疫苗如DNA质粒，纯化的重组卵白和亚单元疫苗，简直须要一种维护情势。在很多动物物种中，可溶性的、非粘附的抗原凡是在低程度时被占用，若在肠道中，这种抗原凡是引起免疫耐受。相反，经由过程粘附聚合物或耦合到自身粘附于上皮概况的卵白质上得以保存在粘膜概况的抗原可加强粘膜的免疫反映。在小鼠和其他几种动物上的研讨明白表白，微胶囊化的疫苗对于粘膜递送具有上风，表示在：M细胞特殊轻易将微粒自动运输到由小肠粘膜远端大批淋巴滤泡构成的聚集淋凑趣，小微粒(直径1毫米)粘附到M细胞的应用效力最高。此外，绒毛上皮细胞顶面、聚集淋凑趣滤泡相干的上皮细胞和M细胞上的特别糖脂和卵白糖链在抗原粘附方面施展了至关主要的感化。已发明，年夜西洋鲑鱼肠道有相似哺乳动物的M样细胞，这些细胞在功效上是等价的，但表型分歧。可以确定，微胶囊技巧可以用于进一步进步上述灭活细菌、酵母或植物疫苗的接收。
但须要留意，接种疫苗的最年夜剂量受制于日采食量和疫苗微囊化后的包封率，而包封率在很年夜水平上取决于被选择封装的载体与细菌联合的状况和生物包埋后的稳固性。疫苗的剂量和裸露时光，特殊是在幼龄动物，对疫苗疗效长短常要害的，这些身分断定能导致免疫应答或耐受的差别。一些聚合物，如壳聚糖、乳酸-乙醇酸(PLGA)、海藻酸盐、脂质体已经利用于微囊化疫苗，例如，海藻酸盐包裹减毒或无毒的活肠道病原菌和病毒后，在经由过程消化道时，藻酸盐的驻留能维护微生物和质粒，而且经由过程肠道粘液层扩散，从而到达细胞概况，与上皮细胞接触，藻酸盐可被抗原细胞摄进，并传递微生物或DNA质粒，肠道病原体有可能激活局部粘膜反映，而DNA质粒可以进进细胞核，采取相似在病毒沾染进程中的方法来触发抗原表达。
6、鱼用口服疫苗的公道免疫方式
毫无疑问疫苗触发恰当的免疫道路是抗衡病原最有用的方式，但这种恰当的免疫反映是若何实现的呢?
病原体激发全身材液免疫反映是恰当的维护，灭活微生物、卵白佐剂疫苗、病毒样颗粒或其他亚单元疫苗足以激发足够的全身性免疫反映。
然而，从今朝的研讨来看，专门引起全身性体液免疫的疫苗，可能不是有用的对粘膜(肠道)的病原体，由于肠外免疫难以有用地引起粘膜反映。
在人类和其他兽医物种，减毒活的病原体(细菌或病毒)和非复制的DNA质粒已被开辟出来，在强佐剂存鄙人经由过程肠外道路可引起全身性的细胞介导的T细胞反映。最主要的是，抗原在宿主的复制和疫苗佐剂的存在会激发局部免疫细胞和抗原递呈细胞活化，免疫细胞的激活是抗原呈递给CD8 T细胞，经由过程MHC-I类道路以及呈递给CD4 帮助性T细胞经由过程交叉性道路来实现。病毒粒子在APC概况的表达也会激活抗原特异性B细胞。Th1细胞排泄IFNγ将进一步保持B细胞活化，发生抗体。是以，如许的反映有助于激活一个完全体液效应，并触发病毒或其他细胞内病原体的细胞介导反映。有趣的是，DNA质粒，虽不克不及在宿主细胞中复制，但已被证实可有用地触发免疫体系，特殊是在鱼类，其应用剂量可比哺乳动物低100倍。一般以为，鱼类的免疫机制是守旧的，体液和细胞介导的免疫反映与全身和粘膜免疫接种维护有关。血清IgM程度与疫苗接种方式相干，特殊是对于细胞外病原体。近年来，在鲫鱼和鳟鱼对T细胞标志CD8和CD4的单克隆抗体开辟就很好的阐明了T细胞对沾染和接种疫苗的反映。别的，2005年，在鳟鱼上发明一个新的免疫球卵白类型定名为IGT，可更好地描写鱼类疫苗与体系和粘膜反映。比来对鱼类粘膜免疫机制的研讨也有报道。
7、口服疫苗触发维护性体液免疫和细胞介导的反映
要触发维护性体液免疫和细胞介导的反映，应从以下几方面斟酌：
起首，M样细胞和抗原呈递细胞靶向感化于鱼肠道。当抗原或疫苗经由过程口服道路给药，它们与共生的肠道微生物城市面对着同样的宿主防御机制。口服疫苗需战胜胃情况、卵白酶或核酸酶的进犯，并穿透厚厚的黏液达到上皮樊篱。是以，须要口服大批抗原，由于不成能准确断定达到上皮层的抗原数目。只有疫苗与顶端上皮细胞接触，才可以被摄取并传递到基底侧，抗原递呈细胞才干处置它。在哺乳动物，抗原需先经摄取后，由M细胞传递给滤泡相干上皮细胞和绒毛上皮细胞的顶端部门。M细胞应用细胞质运输的囊泡将细菌、病毒、可溶性微生物产品或颗粒抗原传递到基底膜的白细胞。M细胞形成一个白细胞可以凑集在内的“口袋”，“口袋”削减了顶端和基底之间的间隔，从而进步抗原达到白细胞的效力。除了M细胞，专门的树突状细胞经由过程上皮层延长直接在管腔内开释抗原。在激活局部免疫反映时，M细胞和上皮的树突状细胞成为疫苗交付的直接目的。已有报道，鲑鱼上皮层内具有必定数目的M样细胞，向管腔侧延长胞质崛起并摄取BSA微粒。固然M样细胞的特异性标记物在鱼类中尚未断定，但有报道，鲑鱼M样细胞相似于哺乳动物的M细胞，在荆豆凝聚素(UEA-1)中为阳性，在麦胚凝聚素(WGA)中为阴性。UEA-1的单个阳性细胞仅见于绒毛粘膜褶皱深处，而不在顶部区。虽白细胞不在基底的“口袋”，但以为巨噬样细胞与基底侧的M样细胞相干。已证实鱼类肠道和上皮的巨噬细胞在第二肠段的抗原摄取中施展感化。上皮内巨噬细胞能有用地摄取和运输抗原，尤其是当抗原联合到肠道粘附分子上。别的，在外周部位也能察看到能运输抗原的游离巨噬细胞。鱼类巨噬细胞的标志物仅存在于少量鱼种中。然而，它们可作为模子鱼类中假定的APC的特有目的，证实细胞特异性抗原传递道路的顺应性。
其次，斟酌引诱免疫耐受和抗原剂量的关系。在哺乳动物中，体内存在着内涵均衡机制，即免疫耐受和免疫效应，是设计口服疫苗的重要障碍。已有报道，调节性T细胞的引诱和耐受与抗原剂量相干。在哺乳动物中，高剂量的口服抗原会引诱掉效和抗原特异性T细胞的缺掉，而低抗原剂量会触发T细胞发育。在鱼类，虽耐受性引诱机制还没有体系的说明，但抗原的剂量和给药道路也与耐受性相干。因为难以准确断定粘膜概况的抗原量，很难在规范前提下鉴定该疫苗会不会发生耐受性。从口服疫苗成长远景来看，疫苗抗原不该仅是在固有膜内传递到抗原呈递细胞，并且应当有较强的能打破肠道耐受性的刺激旌旗灯号。是以应用强盛的黏膜免疫佐剂疫苗或复制型疫苗会更有辅助。
再次，模拟病原体进进并激活粘膜反映。模拟病原体系体例备的疫苗包含：以减毒肠道致病菌作为疫苗载体的减毒活疫苗，包裹的DNA质粒和激活有用的粘膜免疫应答，重组减毒活疫苗载体。
8、公道的疫苗设计和将来疫苗的新方式
近年来，采取活病毒载体作为疫苗载体，是设计疫苗新的标的目的。这些活病毒载体包含杆状病毒、甲病毒、腺病毒等。它们具有一些配合点：1)可以被润饰并在天然物种上应用而不具有致病性;2)可以或许在真核细胞中递送核酸，由宿主细胞自身答应疫苗抗原表达;3)经由过程假型化的病毒，可以设计成靶向感化于被沾染细胞;4)简略的克隆和变异策略。
9、今朝最幻想的口服疫苗的改良方式：粘膜佐剂
在口服给药时，非复制的抗原，如可溶性卵白，质粒DNA的免疫原性很差，由于它们无法激发恰当的炎症刺激旌旗灯号。有用的粘膜免疫佐剂的应用可以年夜年夜进步这些疫苗的有用性。这些佐剂，包含以下几种，一是鉴戒人用或其他物种疫苗的传统佐剂，如明矾、弗罗佐剂、脂质体、皂苷、角鲨烯等;二是肠毒素，肠毒素及肠病原体自己，无论是作为活的传递载体仍是灭活的病原体，都可供给足够的刺激旌旗灯号,都可用于口服免疫制剂的佐剂;三是分子佐剂，即以DNA质粒编码分子或以RNA为基础成分的载体分子作为分子佐剂是可能的，但从今朝来看，这些分子佐剂用于鱼类的口服免疫还很局限。四是基于PAMPs的粘膜佐剂，在鱼类研讨中，关于模式辨认受体、肃清剂受体及C型凝聚素的判定及特点性描写已取得必定提高，可为公道佐剂设计供给标的目的。已有报道，聚肌胞苷酸(poly I:C一种干扰素引诱剂)比拟合适作为鱼类疫苗佐剂，但用于口服疫苗佐剂仍须要评估。五是以植物卵白作为免疫刺激剂打破粘膜耐受性。
10.关于鱼的习惯和情况身分的斟酌
已有研讨表白，选择与鱼情况相匹配的封装方式是十分主要的。在豢养前提下，测试疫苗对靶动物是否有用，与鱼种、所处情况差别及养殖前提有主要的关系。是以，海产养殖动物口服疫苗的设计，应尽可能斟酌分歧鱼种的生涯情况和饮食习惯的差别性。
11、斑马鱼作为海产动物的动物模子
疫苗验证须在适合的物种和其天然发展情况最类似的前提下进行。采取斑马鱼为模子有助于我们尽快搞明白有关疫苗的特点和宿主的免疫反映，例如，口服传递抗原对接收、散布和激活的免疫反映有相对进献的特定细胞类型等的信息。已有以斑马鱼肠道心理和其潜伏利用为模子进行研讨报道。斑马鱼可以证实采取新方式开辟的口服疫苗的有用性，有助于加快抗原、佐剂、疫苗传递载体和封装方式的选择。
当然，应用斑马鱼作为模子在海产养殖物种中仍有必定的局限性。因为杂食动物和食肉动物的肠道菌群和肠道情况的分歧，斑马鱼是鲤科和淡水鱼类的适合模子，但不太合适作为鲑鱼、鳟鱼、年夜菱鲆、鲷科鱼类或鲈鱼的模子。
12、结语
鉴戒人类和兽医口服疫苗方面所取得的胜利，鱼类口服疫苗可从中汲取经验。因为养殖鱼类的物种及其病原体的多样性，现有口服疫苗难以知足市场需求。尽管在曩昔30年中，已有一些有关鱼粘膜免疫学的研讨，但仍处于起步阶段，这与硬骨鱼类的物种差别性年夜有关。
近5～10年，鱼粘膜免疫也有新发明，包含IgT或M样细胞、粘膜免疫学和疫苗学，联合对鱼内脏的研讨表白，M样细胞或抗原呈递细胞将为鱼类疫苗给药供给一种可行的选择。
从分子印迹技巧和遗传学的角度，斑马鱼动物模子可加速鱼类疫苗开辟，相似其他动物模子有助于人类和兽医范畴。对于若何接种口服疫苗、以及设计冲破粘膜耐受性的策略，宿主粘膜反映和鱼类肠道微生物群的信息是必不成少的。别的，学术界的同业和养殖户之间协作，对出产贸易平安有用的鱼用疫苗也是有辅助的。
起源：Oral vaccination of fish: Lessons from humans and veterinary species，Developmental and Comparative Immunology 64 (2016) 118-137
唐晓莹 徐静等
本稿为海产养殖动物疾病防控技巧国度处所结合工程试验室原创编译收拾
